1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶 k 的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是 37ºC 1 h。4.DAB 显色条件的选择。一般 DAB 反应 10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30 min。5.PBS 的充分清洗。在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。6. 内源性 POD 的封闭也十分关键。适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。7. DAB 显色反应大约需要 10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。8.蛋白酶 K 工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。DNase 1 一般室温，10 min 即可。